反相高效液相色谱法常使用的流动相是非极性有机溶剂与极性溶剂的混合物。 其中，非极性有机溶剂例如甲醇、乙腈等，能够溶解非极性化合物；而极性溶剂例如水，能够溶解极性化合物。 这样的混合物可以提供适当的极性程度，使样品具有合适的亲合性与色谱分离性，从而获得良好的分离效果。 在反相色谱中，流动相中溶剂的选择会直接影响分离效果，因此需要根据被测化合物的性质进行合理选取。